霉菌
食品种常见的霉菌
1、曲霉菌属
曲霉菌是一种典型的丝状菌，占空气中真菌的12%左右，它以土壤或空气为媒介, 可引起食物、谷物、豆类和果蔬的霉腐变质，该霉菌在原料贮藏期间几乎不会死亡。因其对干燥抗性强, 故常在一些干燥食品中被分离出来，糖类和壳类处理工厂常被此类霉菌污染，而烘焙产品中也常因原料，如糖、花生、油、大米、大豆、绿豆等原料带入曲霉菌污染。
曲霉显微镜下表现：
（1）曲霉菌丝有隔膜，直径3-6um；
（2）分支呈锐角45°；
（3）菌丝两侧平行。
肉眼可以通过菌落生长速度，表面质地、颜色、形态和气味等鉴别，其中颜色是曲霉菌分类的依据之一 。
（1）烟曲霉
菌落开始为白色，2-3天后转为蓝绿色，但边缘仍为白色，数日后变为深绿色、烟绿色。初为绒状或絮状，随着时间推移变为粉末状，边缘部分也出现颜色，背面无色或带点褐色。
（2）黄曲霉
它是温暖地区常见曲霉菌，在20-30℃最易产生强致癌的黄曲霉毒素，花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。菌落正面色泽也随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状。孢子成熟后颜色变为褐色。表面平坦或有放射状沟纹，背面无色或略呈褐色。
（3）黑曲霉
黑曲霉菌落初为白色，常有鲜黄色区域，厚绒状，继而黑色，背面无色或中央部分略带褐色，且能引起曲霉菌病，还能产生黑曲霉毒素。
（4）土曲霉
土曲霉菌落淡褐色或褐色或土黄色，比较小，呈圆形。
（5）杂色曲霉菌
形紧密，呈绒毛状、羊毛状或两者兼有，颜色变化范围相当广泛，在不同菌株的菌落上，有时局部会出现淡绿、灰绿、浅黄或粉红等颜色，而菌落背面则近乎无色、黄橙色或玫瑰色；有的菌落上会形成无色至紫红色的液滴。
（6）构巢曲霉菌
菌落圆形，暗绿色，中央呈粉末状，边缘绒毛状，当产生大量闭囊壳时呈黄褐色，背面紫红色。
2、青霉
它是一种常见的污染菌，与曲霉一样在自然界中广泛分布，但曲霉生长于中温至高温、孢囊梗末端膨大、多为放射状，而青霉以中温性为主、孢囊梗末端不膨大、多为扫帚状，主要蓝有灰绿青霉黄绿青霉、桔青霉、岛青霉等，从土壤或空气中很易分离。青霉的孢子耐热性较强，菌体繁殖温度较低，酒石酸、苹果酸、柠檬酸等烘焙产品常用的酸味剂又是它喜爱的碳源，因而常常引起这些制品的霉变，青霉也极易污染稻谷，而使米粒变黄，这类变质米称这为“ 黄变米”。
青霉一般在冬季和春季生长旺盛，容易造成稻谷、水果、蔬菜、肉食及衣履腐败。若是加强通风、降低温度，减少空气相对湿度，可以大大减轻青霉的危害。菌落正面有青绿色、蓝绿色、黄绿色和灰绿色，四周有明显的淡色边缘。
3、毛霉
毛霉又叫黑霉、长毛霉，在土壤、粪便、禾草及空气等环境中存在，高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。在工厂湿度高的环境、通风不良的环境与气温差异显著的地方(如湿的地板和天花板) , 常有此霉菌存在。
毛霉分为多种毛霉，通常菌落为絮状，初为白色或灰白色，后变灰至褐灰色，毛霉无假根。毛霉的菌丝多为白色，孢子囊黑色或褐色，孢子囊孢子大部分为无色或浅兰色，因种而异，主要有以下几种：
（1）高大毛霉，孢子梗直立不分枝，菌丝不分枝，菌丝高达3-12cm，菌落初为白色，逐渐变为浅淡蓝色。
（2）总状毛霉，毛霉中分布中最广的一种，孢子梗总状分枝，菌丝灰白，直立稍短。
（3）鲁氏毛霉，孢子梗为假轴状分枝，菌丝在不同的培养基上可略有颜色。
4、根霉
根霉，为腐生菌，最常见的是匍枝根霉【又称黑根霉、面包霉】和米根霉，多生于面包、馒头和富含淀粉质的食物上，使食物腐烂变质，又能引起甘薯软腐病。黑根霉是目前发酵工业上常使用的微生物菌种，能糖化淀粉、转化蔗糖 ，产生乳酸、反丁烯二酸及微量酒精。黑根霉需要氧气才可以存活，最适生长温度约为28℃，超过32℃不再生长。
无定形菌落，初形成时为灰白色或黄白色，成熟后变成灰褐色或黑色。匍匐菌丝弧形，无色，向四周蔓延。孢子囊刚出现时黄白色，成熟后变成黑色。其中的孢子靠气流传播，喜中温，高温偏酸的条件。
5、交链孢霉
交链孢霉属中温性和好湿性霉菌，易造成腐朽、腐败和过敏。在高湿度的工厂环境(如糕点、鱼肉、水产加工与肉食加工环境) 的天花板、墙与地板、配水管的黑色霉菌, 几乎为该菌或枝孢霉。菌落呈绒毛状，多为灰黑色至黑色。
6、镰刀菌
镰刀菌是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种。本可产生镰刀菌毒素，食用霉变的粮食可导致人患病和死亡，某些菌种可诱发人皮肤和角膜溃疡，恶性肿瘤的发生可能与有的菌种有关。
菌核颜色一般有黄色、白色、紫色、红色、绿色等。菌核的形状多为球形，单生或丛生。
霉菌的危害
食品受到霉菌污染容易引起食品的变质，表现为食品表面长出菌丝体，气味异常，失去食品原有的色香味，导致食品软化和腐烂，失去食用价值，甚至会产生霉菌毒素。
目前已知的霉菌毒素有200多种，危害比较严重的有黄曲霉毒素、赫曲霉毒素、发色曲霉毒素等。这些毒素可引起人和动物的急、慢性中毒，并与某些癌症有关，对人体健康和生命安全造成严重威胁。但也不是所有的霉菌都是有害的。例如食品发酵工业制造腐乳、酱油、豆豉等食品就是应用了有益的霉菌，所以不必谈“霉”色变。
霉菌污染的原因
食品发生霉变，可能是加工用料受到霉菌污染，或是储存、运输控制不当引起的。当然，只有温度和湿度等环境条件适宜时，污染了霉菌的食物才有发生霉变的可能。大多数霉菌在湿度为85%~90%、温度在25℃~30℃范围内会迅速繁殖生长。研究结果表明，在粮食、豆类、果类及加工制品中，如常用的大米、小米、小麦、黄豆、油料作物的种子、水果、干果、乳制品、发酵食品和动物饲料中，均发现过霉菌毒素。同时食品霉菌毒素中毒往往表现明显的地方性和季节性，如在南方潮湿的地区和梅雨季节比较容易发生。
如何检测霉菌？
食品中霉菌检测标准是GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，它可以定量测定食品中霉菌数量，用相应的产品标准判定食品中霉菌是否超标。
检测中的注意事项：
1、 取样的代表性
2、 取样工具的无菌
空气中霉菌的孢子含量很高，所以，取样的工具、容器等要经过严格的高压灭菌。
3、 检样的方法
(1)由于霉菌易被携带，所以，检样时操作人员应尽量避免自身携带的可能。
(2)样品的均质及充分振摇。因为有些孢子是连成串的，故均质和振摇能使其充分散开，同时，在各梯度连续稀释时，也要用灭菌吸管反复吹吸几次，使孢子充分散开。
4、培养温度和时间
培养温度 25-28℃培养，5 天后观察。
霉菌检验中常用的培养基：孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、察氏琼脂、高盐察氏琼脂等。
5、检样中常见的问题
(1) 不同稀释度计数结果不相同；
(2) 不生长或生长很好连成片无法计数；
原因：①稀释时未经反复振摇，吹吸，导致孢子未充分散开，影响了计数的结果。②由于培养基不适宜，PH 值低等，致使生长较慢。③观察时间的掌握。真菌生长较慢，故需 5d 后才能观察出结果。
微生物操作中常见问题的讨论与分析
1、 划线获得单个菌落的方法
划不出单个菌落的原因：
(1) 平板上有过多的水分；
(2) 划线时接种环未经反复灼烧；
(3) 多区划线，三区或四区划线。
2、 涂布和倾注的区别：
涂布利于观察，但由于涂布棒上会带有少量的菌液，可能影响计数的准确性；倾注更为准确，但不利于观察菌落的状态。
Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现，对霉菌计数来说，涂抹法有以下几方面优越于倾注法：①培养出的霉菌菌落数较多；②培养所需的时间较短；③霉菌孢子、菌落形态特征发育完全，便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的，在培养基表面生长快，发育好，而混在培养基中发育就受影响，而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。
3、培养基的选择
培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO)，其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长，而CAO则适合于高渗性霉菌生长，酵母菌几乎不长。
在日常检测中我们发现，有些常见的耐高渗性霉菌，如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长，而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方：蔗糖400g，麦芽提取汁20g，酵母提取汁5g，琼脂20g，氯霉素50mg，蒸馏水1000mL；DG18琼脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，氯霉素0.1g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，PH6.5)上则正常生长。孢子、形态特征发育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长，因此，若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌，将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等，更有必要同时采用M40Y或DG18。
由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素，危害较小，而有的菌株即使污染数量不多，但其产生的霉菌毒素却危害较大，因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判断被污染食品的安全程度。
为此，国外有些研究者设计出各类选择性培养基，可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落，非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。
4、 培养基配制时应注意的问题：
(1)灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量；
(2)琼脂培养基不能反复溶化。反复溶化会破坏培养基中的营养成分；
(3)培养基不能反复灭菌，反复灭菌也会导致营养成分的破坏；
(4)含琼脂的培养基灭菌后，要摇匀。
5、 平板的保存：
大多数平板如 VRBA、DC、尿素酶生化管、显色系列等要避光低温保存。
6、 产品的保存：
(1) 干粉培养基：避光干燥，结块后不能使用。
(2) 亚碲酸钾卵黄增菌液、50%卵黄乳液等：冷冻保存，使用时，要常温解冻，避免水浴加热。
(3) 抗生素类：冷藏保存，温度过高会导致灵敏度的下降。
(4) 兔血浆：冷藏保存少量的红色不会影响结果。
7、 观察时间的掌握：
按SN、GB 等标准或培养基的使用说明所述时间进行观察，时间过短或时间过长，单菌落的特征都不会很明显。如单增李斯特氏菌显色培养基，时间短单菌落看不到卵磷脂环，时间长绵羊李氏菌也会产生沉淀环。OXA、PALCAM的观察也如此，时间过长，李氏菌使整个平板成黑色，不利于观察单个菌落。
8、 添加剂的添加：
(1)温度的掌握。卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。
(2)定量。过多会抑制一些目标菌，太少又导致杂菌的过度生长。
8、 培养温度的掌握：
(1)真菌类。25-28℃培养
(2)细菌类。李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在 30℃左右。
(3)其他一般在 36℃左右。
9、 接种方法：
常用的方法主要有划线、三点接种、穿刺接种、倾注接种、涂布接种、液体接种。
10、革兰氏染色方法：
染色时间的掌握、冲洗的方法。
11、生化实验：
(1)接种的方法
(2)氧化型和发酵型实验操作
(3)阳性菌种的对照
(4)接种前的纯化。挑取单个菌落进行一系列的生化。
12、最适计数范围
霉菌菌落由孢子和菌丝组成，相当扩散，在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重叠，影响计数，但数量太少又会产生较大的误差，因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。
我们对这方面作了一些观察研究，首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约106个/mL的孢子悬液，并用血球计数器在显微镜下准确计数，然后将孢子悬液作10-1~10-6倍稀释，吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA，25℃培养5天后计数。30种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示，大部分菌株每平板含有10~50个菌落的稀释度时的计数与显微镜计数结果最接近；有近一半的菌株，每个平板含50~100个菌落已较难计数，而大部分菌株，超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别，因此，应尽量选择10~50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。
而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株，则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围，可在培养基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，庆大霉素(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。
13、关于杀菌的几个概念：(1)抑制：是在亚抑制剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这些因子后生长仍可以恢复的生物学现象。
(2)死亡：在致死剂量因子的作用下或在亚致死剂量因子长时间的作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使移去这种因子后生长仍不能恢复的生物学现象。
(3)防腐：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止食物霉变。
(4)消毒：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到防止感染和传播的作用。
(5)灭菌：利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有病原微生物的一种措施。
如何预防霉菌污染？
那么有什么预防霉菌污染的措施呢?
控制食品中的水分和食品储存环境中的温度、湿度是防霉的主要措施。食物的水分要控制在安全水分以下，如玉米在12.5%以下、花生仁在8.0%以下时，霉菌不易繁殖。
另外食品储藏的场所要具有良好的通风条件，且要防水和防雨。食品储存要注意推陈出新，合理储量，储存的时间不宜过长等。同时为了避免食品受霉菌的污染，打开食品包装后应当及时密封。有条件的可以定期对食品进行检测，一旦发现食品遇到霉菌污染后，及时将受到污染的食品进行分析处理，可大大降低霉菌的污染。
