自新冠肺炎疫情发生以来，全世界都在关注新冠肺炎的相关知识，尤其是防治措施，科研人员与医护人员全力研究新型冠状病毒（COVID-19，以下简称新冠病毒）的检测诊断及其防治措施。COVID-19是一种RNA病毒，其RNA有自我复制和逆转录两种复制方式。病毒在复制过程中容易发生变异，这是RNA病毒的一个共性，如原本为低致病性禽流感病毒株（H5N2、H7N7、H9N2），可经6~9个月禽间流行迅速变异而成为高致病性毒株（H5N1），这给有效疫苗的研制增加了困难。为了减少病毒的散播，更好地控制传染源，需尽早确诊感染者，病原学检测成为患者确诊的主要依据之一，而病毒核酸检测是病原学检查的快速诊断方法。
临床常用的核酸检测技术主要有常规PCR、套式PCR、实时荧光PCR和等温扩增技术等。新冠病毒是通过特定细胞表面的受体入侵细胞造成感染，并利用宿主细胞进行复制增殖，引起宿主发病。病毒核酸检测的原理，即根据病毒碱基寻找区别于其他病毒的核酸序列，由此设计引物或探针，实现核酸序列的“靶向匹配”；再通过细胞裂解液，提取病毒核酸，实时荧光RT-PCR扩增40次循环以上，使其核酸数量可达到足够通过荧光等常规方法进行检测。其中最关键的就是引物和探针的设计，使之与该病毒核酸特定区域高度匹配，即特异性很强，一旦待检标本PCR扩增结果为阳性，则证明该标本中存在该病毒核酸。我国颁布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》中明确指出，鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸为阳性，可作为新冠病毒肺炎的病原学诊断之一，而且下呼吸道标本（痰或气道抽取物）更加准确。但在疫病发生初期有人报道称，新冠肺炎患者中核酸检测的阳性率约为30-50%；而钟南山院士发布的近1100例新冠肺炎患者临床数据CT检查显示，76.4%的患者呈现了肺炎表现，主要为毛玻璃样阴影（50%）和双肺斑片状阴影（46.4%），绝大多数重症患者都能以此确诊。可见，核酸检测不能作为确诊感染的唯一手段，需要结合患者的临床症状和临床影像学检测综合分析。由此，我们需要进行思考，样本的新冠病毒核酸检测为什么阳性率不高呢？这就需要客观地分析疾病的发展过程、样本采集、样本的保存和运输、核酸的提取、扩增体系以及人员操作等诸多方面的因素，同时实验室检测不能离开临床症状资料的分析。
根据深圳市第三人民医院（南方科技大学第二附属医院）国家感染性疾病临床医学研究中心的人员对来自213 名COVID-19 确诊病例的866 份样本检测结果进行的分析，结果显示，发病后0~7 天采集的痰液、鼻拭子、咽拭子三种类型样本中，核酸检测阳性率仅为60%；而且随着病程发展三种类型样本阳性率均有所降低。表明新冠肺炎患者不同的病理时期机体内存在的病毒量不同，不同患者个体病毒存在的主要部位不同，虽然都出现病毒感染，但在相关的部位采集的病毒量较少或根本采集不到病毒，以至于通过实时荧光RT-PCR方法检测不到。如禽流感的潜伏期从数小时到数天，最长可达21天，临床检测采集样本时需采集早期感染的样本。任何疫病都有一定的潜伏期，不同的个体潜伏期长短不一，潜伏期的长短受多种因素的影响，如病毒的毒力、感染的病毒量、患者的大小和品种、营养状况、环境及应激因素等。有的在采样时感染可能发生数天或数周，不能确定标本采集时是否是样本采集的最佳时期。此外，在感染早期临床症状不典型，或病毒复制数量达不到qRT-PCR检测的阈值，所以这些都不可避免会出现无法检出的现象。因此，在出现疑似病例，尤其是疫病高发地区、流行区要连续采集样本，多次检测，结合临床症状综合分析检测结果。因此临床上，任何疫病的确诊都不能仅靠病原学检测1次阴性结果就做出疾病排除性诊断。由此我们设想，如果发病动物经初步诊断可能是病毒性感染，须在动物发病的初期或急性期进行样品的采集，否则机体的免疫系统会吞噬病毒，导致病毒数量减少甚至消失，不易检出，而且临床上病毒感染的晚期极易继发细菌性感染，从而增加检测判断的干扰。兽医临床检测动物活体采样时，一定要选择有典型病症而且未经治疗的病例，这样可以获得动物传染病的基本信息，同样这对细菌学的检测也是至关重要的。对于群体性感染发病的情况，至少要选择5个动物进行样本的采集，每个动物的样品材料要有足够的数量，这样不仅要保证本次的检测顺利，也要为复检准备充足的样品。要想提高核酸阳性检出率，首先要保证样本采集部位的准确性。新冠肺炎患者临床症状主要表现发热、干咳、乏力，有些伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等。针对新冠病毒检测的采集，国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》中指出，鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸，第六版的指南建议采集痰标本，而在第七版提出下呼吸道标本（痰或气道抽取物）最准确。但临床病例个体情况差异较大，有的患者无痰，有的下呼吸道的肺泡灌洗液标本采集不便，导致上呼吸道采集的样本病毒含量低或不含病毒，致使检测结果差异较大。由此可见，兽医临床上我们要对患病动物的典型部位进行采样，或者同一患畜多部位采集且合并采集样本进行检测。在采样前对患病动物进行初步诊断，需选择病原体含量较高的部位进行采集，如呼吸道症状明显的采集鼻咽拭子、口咽拭子，然后放同一采集管中；如有消化道症状的同时采集粪便或肛拭子进行混合保存，然后取混合样进行检测。对确诊为细菌病的动物要注意其血液、尿液、脓汁、分泌物、粪便及肿胀局部组织的渗出液等材料的采集。对于病死畜，需要尽量在无菌条件下采集具有典型病变的器官和组织，以及病原含量较高的脏器或内容物，若需要做病理切片，采集的组织最好在病健结合部。在采集脏器时需注意，一定要保留其被膜或完整的结构，如肾脏要有髄质部等。此外，无论何种疫病病死畜，体内的淋巴结、心、肝、脾、肺、肾有无病变，通常都一并采集。采集人员的操作规范程度同样影响样本的质量及检出率，比如新冠肺炎疑似病例患者鼻咽拭子采样时，要求“三个要”，即要深、要转、要取细胞。“要深”即距离从耳垂到鼻尖长度的一半，“要转”即转动10~15s，转动4~5圈，“要取细胞”即取到鼻咽部的细胞，否则无法保证样本的质量。假如鼻咽拭子采样困难，可考虑口咽拭子采样，此时要注意用拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁3~5次。然后将拭子头浸入含3ml病毒保存液管中，尾部折断弃去，立即旋紧管盖。兽医临床检测时，除了一些拭子采样，我们还会有组织、血液、尿液等样品的采集。无论哪种采集方法和样品，都要规范性操作，需尽量保障无菌的条件，特别是用于微生物学的检查，须采集到含有病毒的细胞和含有细菌的组织等，而且病毒的含量要达到核酸的检测下限。采集后的患畜部位和采样用的器械及盛放容器需进行灭菌处理，避免样品被污染，确保核酸检测的准确性。在规范采集方法和保证样品质量的前提下，还要做好个人的安全防护。因为采集的样品含有很多的不确定因素，我们尽量按照高一级级别的个人防护，确保个人的人身安全。采样时如果发现动物急性死亡，不要随意剖检，需进行血涂片的镜检，确定不是人畜共患的高致病微生物感染，如炭疽等，之后方可进行解剖采样。采样结束后还要对尸体、场地及采样人员进行严格的消毒处理，避免感染性物质的扩散。正确的保存样品，使病料新鲜或接近新鲜的状态，是保证检测结果准确性的前提条件。临床采集的样本会受环境因素、试剂、保存管等因素的影响，导致细胞破碎释放出内源性RNA酶，病毒RNA在空气中也很容易降解，从而影响我们最后的检出效率。原则上，样本采集后最好放在防病毒核酸降解的标本采集管中，且及时送到实验室，尽快完成检测。标本在室温下存放时间过长，容易引起核酸的降解，致使检测结果不能呈现阳性反应。因此，建议样本采集后室温存放不超过2~4h，2~8℃条件下不超过72h，如果不能及时检测需要放在-70℃以下进行保存。同样，在兽医临床上对于发病动物的采样，尤其是采集样本比较多时，或者是夏季采样，一定要尽快完成，争取在4h内完成，对于病死动物需立即采集，否则会出现组织器官的腐败、变质或变性等现象，这将严重影响检测结果的准确性。针对不同检测用途的样品有不同的保存方法，其中血清学检测，一般采集的血液立即置于无菌试管中密封，室温放置1h或37℃ 30min，之后进行冷藏保存，需较长时间转移时要加入适当的抗生素；病毒学检测需要使用含有甘油的保存液低温保存。样本转运时要严格遵守国家对感染性物质的运输要求进行包装和运送，须在专用的转移箱中运送，不要与其他物品混杂。防止病料的外漏，根据检测目的以最快最直接的途径送往检测实验室。另外，对于转运及存放标本的容器使用前后及时用 75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。对于感染性物质的检测，如新冠病毒，在处理前先进行病毒灭活，如56~60℃孵育30min，或用试剂盒自带的采样液灭活病毒。兽医临床上，很多采集的病料其传染性也很难估计，因此最好是灭活后再进行检测，但是，要注意灭活的条件，避免病毒的核酸降解。目前，常用的核酸提取方式有两种，即手工提取和核酸全自动提取仪提取。手工提取过程复杂，步骤繁多，容易交叉污染，而且操作人员掌握的分子生物学知识和操作技能的熟练程度差异较大，很难做到统一的标准化，而全自动核酸提取仪操作可以避免个人手工操作的差异，易于标准化，但在提取过程中可能产生气溶胶，进而交叉感染出现“假阳性”现象，同时不同的提取试剂对最后提取到的核酸数量和质量也可能存在差异。因此，提取的核酸数量和质量的不同，对将来的核酸扩增至关重要，直接会影响最后的检测结果。临床上通过核酸进行病原学的检测，如果采用手工方法提取，一定要严格规范操作过程，使用全自动核酸提取仪提取，在每次提取后要对提取仪喷洒核酸清除剂，然后用纸擦拭干净，最后用75%酒精喷洒擦拭（磁棒除外），紫外灯再至少照射半小时，来最大程度的减少核酸提取过程的污染，提高提取核酸的数量和质量，充分保证检测的准确性、可靠性。因此，核酸提取的操作人员应经过专业的培训，具备基本的分子生物学的相关知识和熟练的操作技能，仪器的规范使用等，避免人员因素和仪器因素对检测结果准确性的影响。核酸扩增体系一般采用国家标准推荐的反应体系和试剂，为了降低加样的影响，可适当扩大反应体系，如采用40μl或50μl的反应体系，或通过实验摸索适合本实验室检测的合适的反应体系。另外，每批次扩增建议设置一个弱阳性质控和三个阴性质控，且三个阴性质控的位置要随机放置在不同的位置，只有弱阳性质控检测为阳性，三份阴性质控全部检测为阴性，才视为在控，方可判定样品的检测结果，否则则为失控，应及时分析原因，然后重新采样、重复检测。在质控在控的条件下，同一份标本中出现不同的检测结果，也应分析原因，必要时重新检测样本。自应用PCR检测病原以来，出现了诸多的核酸检测试剂盒。不同厂家的试剂盒根据病毒基因的特异性序列设计的扩增引物和探针，包含有不同的靶基因位点的试剂检测灵敏度不同，特异性也不同，试剂中的酶和金属离子的成分与质量也存在差异，这些最终都将影响核酸的扩增效率和检测结果。如万圣等2017年报道对三种禽流感病毒核酸检测试剂盒比较，阳性检出率分别为70.0%、45.0%和45.0%。因此，不合适的试剂势必导致核酸提取失败，影响核酸检出率。因此，在进行批量检测前，一定要进行试剂盒的比对试验，选择灵敏度较高的试剂盒。众所周知，RNA病毒容易在传播中发生变异，目前现有的试剂盒主要是针对病毒基因组的保守序列进行引物设计，由于我们对病毒的认知还存有一定的空白，病毒在进化过程中其保守序列是否会发生突变还不清楚，核酸的检测试剂也缺乏大规模的临床验证，若病毒RNA的引物设计区发生了突变，可直接导致检测结果不能呈现阳性。
对采样和检测人员进行系统的培训，使其在工作前能充分掌握兽医专业基础知识，对于常见病和多发病，了解其发病表现和病原的流行病学规律，这是准确采集病料的基本条件。同时，还要进行操作技能培训，尤其是样本的采集方法，样品的保存和运输要求，微生物的分离鉴定，核酸的检测流程、血清学检测方法等，正确规范的操作技能，不仅能有效防止感染性物质的扩散，保证样品的质量和检测效果，还能防护个人安全。首选国家相关部门批准的核酸检测试剂盒，然后实验室对试剂盒检测能力验证分析，挑选灵敏度高、特异性强的试剂盒，作为本实验室检测购买的标准。另外，针对不同地区的发病情况，再一次筛选，选取适合病原微生物地方分型的检测试剂，这样尽可能的保证本实验室检测的阳性率和可靠性。另外，要选择合适的核酸质控品和标准物质，这些在检测标准化和敏感性评价中发挥着重要的作用。众所周知，相比于人类病毒核酸标准物质，动物病毒核酸的标准物质的研究明显滞后。现有的商品化病毒核酸检测试剂盒中，作为质控品的阳性对照多由厂家自行制备提供，缺乏统一的质量控制和量值标定，限制了其监控检测的性能，也难以满足不同试剂和不同实验室检测能力评价的需求。纵观目前动物病毒核酸质控品研制的特点和优缺点分析，以噬菌体为基础的内嵌病毒样颗粒与全病毒颗粒最接近，对动物RNA病毒核酸标准物质的研究和应用都有着较为广阔的前景。病毒核酸的检测是疾病确诊的关键步骤，采样和检测人员要充分做好生物安全防护的同时，必须要按照规范处理流程才能有效保障检测结果的准确性、可靠性。首先检测人员应在安全防护的条件下从运输箱中取出样本管，仔细核对采集的样品信息，标记和录入相关的信息；然后注意样本管外部消毒处理，病原的灭活；之后才能进入二级生物安全实验室进行相应的操作，必须在生物安全柜内打开样品管，根据试剂盒要求进行核酸的提取、扩增、数据分析、结果审核等操作。样品检测完成后要立即进行严格的终末消毒程序，如空气、工作台、地面、生物安全柜、样品转运箱等严格彻底地消毒。在条件允许的情况下，实验室检测区进行合理的划分，尽量确保专屋专用，仪器设备不共用，尤其是核酸检测分析室。另外，优化各项检测人员的管理，每项检测需有专门的人员负责，不交叉，不是本项检测的人员不得进入实验室该项目检测区域。根据国家相关部门的综合数据分析要求，进一步制定本实验室的结果解读规范，撰写疫病检测尤其是核酸检测、血清学检测的操作规范，并组织培训实施。实验室制定严格的实验室个人防护和消毒流程。样本采集时和进入实验室前，务必采用相应的生物安全防护等级方可进入，如戴防护口罩、帽子、穿一次性隔离衣、防护服、防护靴套、戴护目镜或面罩、戴双层手套等。检测工作结束后，在实验室相对缓冲间按规范流程脱掉防护装备后再出实验室。工作人员离开实验室必须洗手和手消毒。相应的防护装备也应按照相应的消毒清洗流程，如：实验室空气消毒，移动式紫外灯消毒1h，走廊进行紫外消毒30min；工作台面消毒，每天实验后使用0.5%~1% 有效氯消毒台面和地面；生物安全柜消毒，每天实验后用75%酒精对生物安全柜进行擦拭，再开紫外灯消毒30min；转运容器消毒，转运及存放标本的容器使用前后及时用 75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。近年来，尽管以核酸扩增为基础的分子检测技术，以其具有快速、敏感、特异、定量准确，并且对实验室生物安全环境要求低等特点，在动物疫病病原的检测中得到了广泛的应用，逐渐成为确诊动物疫病病原检测的主要手段，但兽医临床的核酸检测无法保证结果百分百准确的现象，如同新冠病毒的核酸检测，不能将其作为临床诊断的唯一依据。在实际检测时一定要结合患畜的临床症状和其他实验室检查（血清学检测等）进行综合分析、综合诊断，提高检测的灵敏度和准确率。
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